Kits de nettoyage et de concentration de l'ARN

Figure 2. Nettoyage efficace pour produire un ARN total de haute qualité compatible avec l'analyse par bioanalyseur. L'ARN total a été isolé à partir de 0,75 million de cellules HeLa à l'aide d'un réactif d'extraction de l'ARN à base de phénol d'un concurrent. L'ARN obtenu a ensuite été purifié à l'aide du kit de nettoyage et de concentration d’ARN de Norgen. Comme témoins, l'ARN total a été extrait à l'aide du kit de purification de l'ARN total de Norgen (#17200, sans phénol) ou du réactif d'extraction de l'ARN à base de phénol uniquement, sans nettoyage. La résolution de 1 µL des 50 µL d'ARN purifié sur une puce Agilent RNA Nano 6000 a montré que, sans nettoyage, l'échantillon d'ARN isolé à l'aide du réactif d'extraction d'ARN à base de phénol ne se résolvait que faiblement sur un bioanalyseur. En revanche, l'ARN extrait avec le réactif d'extraction d'ARN à base de phénol suivi d'un nettoyage avec le kit de nettoyage et de concentration de l'ARN de Norgen s'est résolu correctement sur le bioanalyseur, montrant une excellente qualité.

Figure 3. Concentration et détection efficaces de faibles quantités d'ARN. Le kit de nettoyage et de concentration de l'ARN de Norgen permet de concentrer efficacement les entrées d'ARN de l'ordre du picogramme. Des quantités croissantes d'ARN HeLa dans des volumes d'entrée de 50 µL ont été concentrées à 20 µL à l'aide du kit de nettoyage et de concentration de l'ARN de Norgen. Une aliquote de 10 µL de l'ARN purifié a ensuite été utilisée comme modèle dans une réaction de qRT-PCR pour détecter le gène S14. Les quantités indiquées sur le graphique correspondent à la quantité d'ARN qui a été utilisée comme intrant pour la réaction qRT-PCR, ce qui démontre la performance constante du kit, même dans la gamme des picogrammes.

Figure 4. Nettoyage efficace pour produire des transcrits d'ARN de haute qualité. Le kit de nettoyage et de concentration de l'ARN de Norgen nettoie efficacement les transcrits d'ARN avec un taux de récupération élevé. Trois transcriptions d'ARN (1-3) de tailles différentes (266n, 161n et 419n, respectivement) ont été produites à l'aide du kit de nettoyage et de concentration de l'ARN de Norgen. Les transcriptions d'ARN obtenues ont ensuite été purifiées à l'aide du kit de nettoyage et de concentration de l'ARN de Norgen. La résolution de 7,5 µL des 50 µL d'ARN nettoyé (C) ainsi que d'un volume égal de l'entrée non nettoyée (I) sur un gel MOPS 1X, 1,5 % de formaldéhyde-agarose a montré que la transcription de l'ARN a été nettoyée avec succès par le kit de nettoyage et de concentration de l'ARN de Norgen.

Figure 5. Nettoyage efficace pour produire des transcriptions d'ARN de haute qualité compatibles avec l'analyse par Bioanalyseur. Le kit de nettoyage et de concentration de l'ARN de Norgen nettoie efficacement les transcriptions de l'ARN avec un taux de récupération élevé. Trois transcriptions d'ARN (1-3) de tailles différentes (266n, 161n et 419n, respectivement) ont été produites à l'aide du kit de nettoyage et de concentration de l'ARN de Norgen. La résolution de 1 µL des 50 µL de transcrits d'ARN nettoyés sur une puce Agilent RNA Nano 6000 a montré que les transcrits d'ARN nettoyés par le kit de nettoyage et de concentration de l'ARN de Norgen se sont résolus correctement sur le bioanalyseur, montrant une excellente qualité.

Figure 6. Excellente qualité d'ARN concentré.. L'ARN total isolé des cellules HeLa (2 µg) a été concentré à 8 µL avec l'aide du kit de nettoyage et de concentration de l'ARN (RNA Clean-Up and Concentration Micro-Elute Kit). L'excellente qualité est indiquée par l'électrophorégramme généré à l'aide du Bioanalyseur Agilent 2100 (RIN > 9). L'ARN concentré est un véritable « ARN total », comme le montre la présence de petites espèces d'ARN.

Figure 7. Récupération élevée de l'ARN concentré. L'ARN total isolé des cellules HeLa (17,5 µL) a été concentré à 8 µL à l'aide du kit de nettoyage et de concentration de l'ARN (RNA Clean-Up and Concentration Micro-Elute Kit), ce qui a entraîné une augmentation de 2 à 2,2 fois de la concentration de l'ARN, comme l'a montré la quantification effectuée par le Bioanalyseur Agilent 2100.

Figure 8. Concentration de l'ARN total. Les quantités indiquées d'ARN HeLa ont été concentrées à l'aide du kit de nettoyage et de concentration de l'ARN (RNA Clean-Up and Concentration Micro-Elute Kit). Pour chaque quantité d'entrée, un volume de 17,5 µL a été traité et l'ARN a été élué dans 8 µL, ce qui donne une concentration de 2,2 fois. Trois microlitres de chaque éluat ont été utilisés dans des réactions RT de 10 µL avec l'amorce oligo-dT, suivies d'une PCR en temps réel utilisant 3 µL de l'ADNc résultant et des amorces spécifiques du gène RPS15 humain. En moyenne, les amplifications de l'ARN concentré ont atteint le seuil de 1 Ct avant les données échantillons d'ARN, ce qui était attendu sur la base du facteur de concentration. La quantité d'entrée la plus faible utilisée (240 pg) n'a pas été amplifiée juste qu'à ce qu'elle a était concentrée (échantillon le plus à droite sur la figure).

Figure 9. Concentration d’ARN micro. Les quantités indiquées d'ARN HeLa ont été concentrées à l'aide du kit de nettoyage et de concentration de l'ARN (RNA Clean-Up and Concentration Micro-Elute Kit). Trois microlitres de chaque éluat de 8 µL ont été utilisés dans des réactions RT de 10 µL avec l'amorce miR-21-SLR, suivies d'une PCR en temps réel utilisant 3 µL de l'ADNc résultant et l'amorce directe spécifique pour miR-21.

Figure 10. Concentration de l'ARN avant les applications de séquençage de nouvelle génération (SNG). L'ARN total a été purifié à partir de 200 µL de plasma prélevé sur des tubes de sang EDTA à l'aide du kit de purification de l'ARN total de Norgen (Cat. 17200) et élué dans 50 µL de solution d'élution. Le même ARN a également été concentré deux fois en utilisant la colonne d’ARN micro-élute en éluant dans 25 μL de solution d’élution. Cinq microlitres de l'ARN sans concentration supplémentaire et d'ARN concentré 2X ont été utilisés comme donnée pour générer des librairies d'ARN (en utilisant l’ensemble de préparation de bibliothèques de petits ARN NEBNext® pour Illumina® et en suivant les instructions du fabricant) pour la NGS de petits ARN sur la plateforme MiSeq (Illumina). A) Les bibliothèques de petits ARN préparées ont été visualisées sur un gel de polyacrylamide TBE à 6 %, où la bibliothèque préparée avec l'ARN concentré 2X, contenait plus de produits ADNc ARN micro ligaturés/indexés (147-160 pb) que la bibliothèque préparée avec l'ARN non concentré. B) L'ADNc a été extrait des bandes de gel excisées et analysé à l'aide du bioanalyseur Agilent 2100 (Test ADN haute sensibilité). Comme on pouvait s'y attendre sur la base des données d'entrée, la bibliothèque de petits ARN préparée avec l'échantillon d'ARN concentré 2X était environ deux fois plus concentrée que la bibliothèque préparée avec l'ARN sans concentration préalable (39,8 contre 21,2 nM, respectivement).