Tubos conservantes de cf-ADN/cf-ARN

Figura 2. Sin pérdida de volumen plasmático tras el envío/transporte. Se extrajo sangre de 6 donantes diferentes por duplicado. Un juego se conservó en el laboratorio a temperatura ambiente y el otro se embaló en una caja aislante y se envió desde Thorold, ON, por transporte aéreo nocturno hasta Winnipeg, MB, y de vuelta a Thorold, ON (tiempo transcurrido: 72 h). A su regreso, las muestras conservadas se almacenaron a temperatura ambiente durante 7 días antes de separar el plasma. El volumen de plasma recuperado de los tubos conservadores de cf-ADN/cf-ADN de Norgen no cambió antes del envío ni después del envío (6-7 mL de plasma recuperado). Tanto para los tubos de la competencia como para los tubos EDTA, el volumen de plasma recuperado antes del envío fue de ~ 4 mL y después del envío fue de ~ 2,5 mL.

Figura 3. Hemólisis de la sangre recogida medida a lo largo del tiempo. Se extrajeron muestras de sangre en: 1) Tubos EDTA, 2) Tubos de la competencia y 3) Tubos conservantes cf-DNA/cf-RNA de Norgen y almacenados hasta 30 días. La hemólisis se determinó midiendo la absorción de la hemoglobina libre en el plasma de 3 sujetos a 414 nm durante varios puntos temporales. Se muestra la absorción media. La cantidad de hemoglobina libre aumentó rápidamente con cada día adicional de almacenamiento en los tubos EDTA y en los tubos de la competencia, y se mantuvo relativamente constante en los tubos conservadores cf-ADN/cf-ADN de Norgen.

Figura 4. Impiden la lisis celular y la liberación de ADNg y la acumulación de la escalera apoptótica en el plasma. Muestras de sangre extraídas en tres tubos diferentes (tubos conservadores de cf-ADN/cf-ARN de Norgen, EDTA y competencia) y almacenadas hasta 30 días. Los tubos conservantes cf-ADN/cf-ARN de Norgen ayudan a prevenir la liberación de gADN de alto peso molecular en el plasma a la vez que minimizan la acumulación de la escalera apoptótica contaminante de los leucocitos moribundos de sangre periférica. Como se indica en el círculo negro, la contaminación por gADN es muy baja en comparación con los tubos de la competencia y EDTA. Esto es indicativo de niveles muy bajos de lisis celular y la subsiguiente liberación de gADN en la muestra de plasma conservada.

Figura 5. Efecto del almacenamiento a alta temperatura (37°C) durante 8 días. Las muestras de sangre se extrajeron en tubos EDTA, tubos de la competencia o tubos conservantes de cf-ADN/ cf-ADN de Norgen y se almacenaron a 37°C. A continuación, se aisló el cf-ADN del plasma procesado. La concentración de gADN se determinó mediante PCR en tiempo real utilizando una diana larga del gen ALU (247 pb). El gADN - diana en tubos EDTA mostró un descenso significativo del valor Ct.después de 1 día de almacenamiento a 37°C en comparación con el punto temporal inicial, y continuó descendiendo hasta el 8º día de almacenamiento. Para la competencia, el gADN - diana permaneció estable hasta el 4º día de almacenamiento y después los valores Ct. empezaron a caer significativamente, indicando una pobre estabilización más allá del 4º día. Los tubos conservantes de cf-ADN/cf-ADN de Norgen estabilizaron las muestras durante 8 días.

Figura 6. Alta cantidad de cf-ADN de plasma conservado utilizando los tubos conservantes cf-ADN/cf-ADN de Norgen. Las muestras de sangre del mismo donante se extrajeron en tubos Competitor o en tubos conservantes cf-ADN/cf-ARN de Norgen y se almacenaron a temperatura ambiente durante 7 días. El tubo conservador cf-ADN/cf-ARN de Norgen recuperó 6,5 mL de plasma mientras que el tubo de la competencia recuperó 3,5 mL de plasma. A continuación, se aisló el cf-ADN de todo el volumen de plasma recuperado de cada tubo utilizando el kit de purificación de ADN circulante libre de células en plasma/suero Midi de Norgen (Cat. 55600) y el kit de purificación de ADN circulante libre de células en plasma/suero Maxi de Norgen (Cat. 55800). La cantidad de ADN recuperado de ambas muestras se evaluó utilizando el chip Agilent Bio-analyzer High Sensitivity DNA. Como puede observarse en el trazado del bioanalizador, el tubo con conservante de Norgen produjo más cf-ADN (pico azul) que el cf-ADN recuperado del tubo con conservante de la competencia.

Figura 7. Efecto del almacenamiento a temperatura ambiente sobre el cf-ARN, ejemplificado por el transcrito 18S rRNA, el transcrito HPRT1 mRNA y miR-21. Las muestras de sangre se extrajeron en: 1) Tubos de la competencia o 2) Tubos conservadores de cf-ADN/cf-ADN de Norgen. Los tubos de la competencia se almacenaron a temperatura ambiente durante 14 días, mientras que los tubos conservadores de cf-ADN/cf-ADN de Norgen se almacenaron durante 30 días a temperatura ambiente. A las horas indicadas se procesó cada tubo y se separó el plasma. Se aisló el cf-ARN y se determinó la estabilidad del cf-ARN purificado mediante amplificación rt-qPCR dirigida al transcrito del 18S ARNr, el transcrito del ARNm HPRT1 y miR-21. Los niveles de estos tres objetivos deben permanecer invariables mientras dure la estabilización. El competidor mostró valores Ct significativamente más altos para las tres dianas después de 7 días, indicando la degradación del cf-ARN, mientras que el cf-ARN se mantuvo estable durante 30 días a temperatura ambiente para los tubos conservantes de cf-ARN/cf-ARN de Norgen.

Figura 8. Efecto del almacenamiento a temperatura ambiente en la conservación de proteínas plasmáticas durante 30 días. Las muestras de sangre se extrajeron en tubos conservadores de cf-ADN/cf-ADN de Norgen y se almacenaron durante 30 días a temperatura ambiente. A las horas indicadas se procesó cada tubo para la recuperación de plasma y se purificaron proteínas de 50 µL de plasma utilizando el kit de agotamiento de proteínas séricas abundantes ProteoSpin™ de Norgen (Cat. 17300) . La estabilidad de las proteínas plasmáticas purificadas A) agotadas y B) altamente abundantes se evaluó en un gel SDS-PAGE al 12 %. Tanto las proteínas plasmáticas agotadas como las proteínas plasmáticas altamente abundantes resultaron ser estables durante 30 días a temperatura ambiente sin ningún signo de degradación proteica.