Kit de purificación de ARN total

Figura 2. Amplificación de ARN grandes y pequeños en la misma extracción. El kit de purificación de ARN total de Norgen aísla toda la gama de tamaños de ARN, incluidos los ARN pequeños, sin utilizar fenol. El ARN total se aisló a partir de 0,75 millones de células HeLa utilizando el kit de purificación de ARN total de Norgen, varios competidores a base de sílice y el reactivo TRI a base de fenol. La RT-PCR se realizó según Shi y Chiang (2005). Quince microlitros del ARN aislado de 50 µl se poliadenilaron en una reacción de poli(A)-polimerasa de 50 µl. Se utilizaron cuatro microlitros del ARN poliadenilado en una reacción de transcripción inversa de 20 µl con un cebador adaptador poli T. Se utilizó un microlitro de la transcripción inversa en una reacción qPCR de 20 µl con cebadores contra los microARN humanos (miR-19 y miR-21) y el ARNm grande (S15). Sólo el uso del kit de purificación de ARN total de Norgen dio lugar a la detección tanto de microARN como de productos de amplificación de ARNm similares a los del kit del competidor 2, pero sin el uso de fenol.

Figura 3. Alta calidad del ARN a partir de una gama diversa de aportes. El kit de purificación de ARN total de Norgen permite aislar ARN de una amplia gama de especies o tipos de tejidos. El ARN total se aisló a partir de 5 x108 células E. coli, 1 x106 células HeLa, 100 µl de sangre de rata y 10 mg de riñón de hámster utilizando el kit de purificación de ARN total de Norgen. Un microlitro de los 50 µl de ARN aislado se analizó en el bioanalizador Agilent® 2100 utilizando un chip RNA Nano 6000. Obsérvese la integridad del ARN de todas las entradas con presencia de pequeñas especies de ARN. El kit de purificación de ARN total de Norgen aísla sistemáticamente ARN de alta calidad a partir de diversos insumos que obtienen un valor RIN de entre 8 y 10.

Figura 4. Gran sensibilidad de aislamiento. El kit de purificación de ARN total de Norgen permite la extracción sensible de ARN a partir de una sola célula. Se extrajo ARN total de un número decreciente de 293 células HEK, desde 1 millón de células hasta una sola célula. A continuación, cinco microlitros de los 50 µl de ARN aislado se sometieron a una transcripción inversa de 20 µl utilizando el cebador oligo dT. Tres microlitros de la transcripción inversa se utilizaron en una reacción de PCR de 20 µl con cebadores para detectar los transcritos de beta-actina humana. Se detectaron productos PCR de beta-actina a partir de una sola célula. M es el carril marcador.

Figura 5. Aislamiento lineal y sensible de ARN grandes y pequeños. El Kit de Purificación de ARN Total de Norgens permite el aislamiento consistente de ARN grandes y pequeños a partir de diferentes cantidades de entrada. Se aisló ARN total de 10 a 100.000 células HeLa utilizando el kit de purificación de ARN total de Norgen (azul), un kit basado en sílice de la competencia (verde) y un método de extracción de ARN basado en fenol (rojo). La expresión relativa de miR-21 (panel A) y S15 (panel B) se determinó mediante RT-qPCR de muestras de ARN total. En resumen, un microlitro de los 50 µl de ARN aislado se sometió a una transcripción inversa de 20 µl utilizando el cebador inverso de bucle de tallo de miR-21 o el cebador oligo dT. Se utilizaron dos microlitros de la transcripción inversa en una reacción de PCR en tiempo real de 20 µl con cebadores para detectar el miR-21 humano (panel A) y los transcritos S15 (panel B). Los valores de ciclo umbral (Ct) resultantes se representaron gráficamente frente al número de células de entrada. El ARN aislado mediante la purificación de ARN total de Norgen presentó la mejor linealidad (R2 más alto) y sensibilidad (Ct más bajo) tanto para el ARN grande (S15) como para el ARN pequeño (miR-21).

Figura 6. Detección eficaz y consistente de miARN a partir de plasma. El kit de purificación de ARN total de Norgen puede aislar eficazmente el miARN del plasma. El ARN total se aisló a partir de 50, 100 o 200 µl de plasma de rata por triplicado utilizando el kit de purificación de ARN total de Norgen (azul), un kit basado en sílice de la competencia (verde) y un método de extracción de ARN basado en fenol (rojo). Se realizó una RT-qPCR de asa de vástago utilizando cebadores específicos para miR-21. En resumen, dos microlitros de los 50 µl de ARN aislado se sometieron a una transcripción inversa de 20 µl utilizando el cebador inverso de bucle de tallo de miR-21 o el cebador oligo dT. Tres microlitros de la transcripción inversa se utilizaron en una reacción de PCR en tiempo real de 20 µl con cebadores para detectar el miR-21 humano. El kit de purificación de ARN total de Norgen es el único producto que mostró (1) detección consistente de transcritos de miR-21 en todos los volúmenes de entrada, y (2) valores de Ct correlacionados con el volumen de entrada (disminución de Ct con el aumento de entrada).

Figura 7. Recuperación de diversas especies de miARN del plasma con mejor consistencia. El kit de purificación de ARN total de Norgen aísla el ARN plasmático que se comporta de forma más consistente en aplicaciones posteriores como los microarrays. El ARN total, incluido el miARN, se aisló de 100 µl de plasma de ratón por duplicado utilizando el kit de purificación de ARN total de Norgen, el kit de miARN líder de Competitor 1 o un método de extracción de ARN basado en fenol. Cien nanogramos de ARN extraído de cada kit se aplicaron a un kit de perfiles de expresión de microARN de Illumina. Los gráficos de dispersión muestran una mayor coherencia (mejor agrupación) de las señales replicadas de las muestras de Norgen. Los genes con Pval < 0,01 para ambas réplicas aparecen en azul. La tabla asociada sugería que el protocolo de Norgen recuperaba la misma diversidad de miARN con mejor consistencia (mayor valor r2 ).

Figura 8. Mayor diversidad de miARN detectados en plasma. El kit de purificación de ARN total de Norgen aísla miARN del plasma con mejor diversidad que un competidor líder. El ARN total, incluido el miARN, se aisló a partir de 100 µl de plasma utilizando el kit de purificación de ARN total de Norgen o de 625 µl de plasma utilizando el kit de miARN líder del competidor A, y se aplicó a un kit de perfiles de expresión NCode. Las imágenes de micromatrices sugieren que el kit de purificación de ARN total de Norgen (izquierda) aísla una mayor diversidad de miARN a partir de una menor cantidad de plasma que el kit de miARN de la competencia (derecha). Imagen cortesía de LC Sciences, Houston.

Figura 9. Mejor diversidad de miARN detectados en células HeLa mediante secuenciación de próxima generación de ARN pequeños de Illumina. El kit de purificación de ARN total de Norgen aísla miARN de células HeLa con mejor diversidad que un competidor líder. El ARN total, incluido el miARN, se aisló a partir de 1 millón de células HeLa utilizando el kit de purificación de ARN total de Norgen y el kit de miARN líder de Competitor Q, y se aplicó a la secuenciación de próxima generación de ARN pequeño de Illumina en un secuenciador MiSeq. El panel A muestra que el kit de purificación de ARN total Norgens recupera un mayor número de miARN que el competidor. En particular, la mayor diversidad se consigue con un procedimiento más rápido y sencillo en tan sólo 20 minutos de tiempo de preparación de la muestra de ARN sin utilizar fenol. El panel B es un gráfico de dispersión del RPM medio (lecturas por millón) de los miARN detectados utilizados para comparar la recuperación de miARN de Norgen y del kit de la competencia. El kit de purificación de ARN total de Norgens recuperó un número significativamente mayor de miARN que tienen RPM más altas, como se resume en el inserto del gráfico así como en el panel C.

Figura 10. Producción consistente de ARN de alta calidad con una gama completa de tamaños sin el uso de fenol. El kit de purificación de ARN total de 96 pocillos de Norgen permite el aislamiento consistente de ARN de alta calidad, con tamaños completos que van desde el ARN muy grande hasta el ARN pequeño sin el uso de fenol. El ARN total se aisló a partir de alícuotas de 0,5 ml de un cultivo de una noche de E. coli (~5 x108 células/mL) utilizando el kit de purificación de ARN total de 96 pocillos de Norgen en 16 réplicas. Cinco microlitros de los 75 µl de ARN aislado se resolvieron en un gel de agarosa con formaldehído al 1,2 %. Las 16 réplicas mostraron tanto un alto rendimiento como una alta calidad. Además, todas las réplicas mostraron una recuperación eficaz de todos los tamaños de ARN, incluido el ARN pequeño (flecha).

Figura 11. Alta calidad del ARN a partir de una gama diversa de aportes. El kit de purificación de ARN total de 96 pocillos de Norgen permite aislar el ARN de una amplia gama de especies y tipos de tejidos. Se aisló ARN total a partir de 8 mg de tejido cerebral (líneas A), renal (líneas B), hepático (líneas C), pulmonar (líneas D) y esplénico (líneas E), 7,5 x105 células HeLa (líneas F) y CHO (líneas G), y 5 x108 bacterias (líneas H) utilizando el kit de purificación de ARN total de 96 pocillos de Norgen. Cinco microlitros de los 75 µl de ARN aislado se resolvieron en un gel de agarosa con formaldehído al 1,2 %. De la observación del gel de formaldehído-agarosa se desprende que el kit de Norgen puede utilizarse para aislar con éxito el ARN total, incluidas las especies de ARN pequeño, a partir de una amplia gama de tipos de muestras.

Figura 12. Aislamiento de ARN grandes y pequeños. El kit de purificación de ARN total de 96 pocillos de Norgen permite aislar de forma consistente tanto el ARN grande como el pequeño. El ARN total se aisló a partir de muestras de 5 x105 células HeLa utilizando el kit de purificación de ARN total de 96 pocillos de Norgen. A continuación, se utilizaron alícuotas de cada muestra de ARN total en 2 reacciones RT-qPCR diferentes. Diez microlitros de los 75 µl de ARN aislado se sometieron a una transcripción inversa de 20 µl utilizando cebador inverso de bucle troncal de miR-21 u oligo dT. Se utilizaron tres microlitros de la transcripción inversa en una reacción de PCR en tiempo real de 20 µl con cebadores para detectar el miR-21 humano (panel A) y los transcritos S15 (panel B), respectivamente. Tanto el ARNm como el microARN se amplificaron de forma consistente a partir de todas las muestras, con una baja variabilidad de los valores Ct. Por lo tanto, ambos tipos de ARN se aíslan sistemáticamente con este kit.

Figura 13. Gran sensibilidad al aislamiento. El kit de purificación de ARN total de Norgen permite la extracción sensible de ARN incluso de menos de 10 células. La RT-qPCR se utilizó para detectar ARNm aislado a partir de diversas cantidades de células HeLa, desde 100.000 hasta una sola célula, utilizando el kit de 96 pocillos de purificación de ARN total de Norgen. A continuación, diez microlitros de los 75 µl de ARN aislado se sometieron a una transcripción inversa de 20 µl utilizando cebadores oligo dT. Se utilizaron tres microlitros de la transcripción inversa en una reacción de PCR en tiempo real de 20 µl con cebadores para detectar los transcritos S15 humanos. Los valores Ct resultantes se representaron gráficamente frente al número de células de entrada. El ARN total se aisló y detectó linealmente a partir de una sola célula HeLa.